• 产品名称:基于单分子定位技术的超分辨显微成像_激光网九
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  • 发布时间: 2021-08-23
产品详细

  在生命科学、生物医学、化学科学、材料科学等领域中,对目标物质成像是一种重要的研究方法,随着研究的深入,被成像目标的尺寸也变得越来越小,以蛋白质、核苷酸、细胞骨架等为例,需要观测目标的尺寸在1-50nm。常规的宽场显微镜,属于远场成像方法,由于受到衍射极限的限制,分辨率只有200nm,远不能达到分辨亚细胞器结构的能力。

  在生命科学、生物医学、化学科学、材料科学等领域中,对目标物质成像是一种重要的研究方法,随着研究的深入,被成像目标的尺寸也变得越来越小,以蛋白质、核苷酸、细胞骨架等为例,需要观测目标的尺寸在1-50nm。常规的宽场显微镜,属于远场成像方法,由于受到衍射极限的限制,分辨率只有200nm,远不能达到分辨亚细胞器结构的能力。近场成像技术,例如电子显微镜、扫描隧道显微镜、原子力显微镜等,能得到0.1nm的超高分辨率,但是由于这些近场成像技术使用的实验设备复杂、价格昂贵,并且对样品的制备有很高的要求,不适于活细胞成像等原因,限制了近场成像技术在科学研究和医学等领域的适用性。

  基于单分子定位的超分辨技术的核心是,如果图像上的点不是同时亮起来,也就是不会有两个靠的很近的点同时亮,就可以通过定位的方式实现超分辨。虽然一次定位只能得到少数几个分子,但是通过数千张图片对数十万个单分子定位,就可以获得一张高分辨率的图像。

  STORM技术中,使用Cy3和Cy5分子对作为荧光标记实现超分辨成像,因为不同波长光可以控制Cy5在荧光激发态和暗态之间切换,例如红色633nm激光可以激活Cy5发射荧光,同时长时间照射可以将Cy5分子转换成暗态不发光。之后用绿色的532nm激光照射Cy5分子时,可以将其从暗态转换成荧光态,而此过程的长短依赖于第二个荧光分子Cy3和Cy5之间的距离,因此,当Cy3和Cy5交联成分子对时,具备了特定的激发光转换荧光分子发射波长的特性。在显微观察前,首先将待测观察样品用染剂染色,将Cy3和Cy5分子对胶联到特异的蛋白质抗体上,就可以用抗体来标记细胞的内源蛋白,然后用波长为633nm的红光长时间照射样品使Cy5发射荧光后全部转化为暗态,采用波长为532nm的绿光激发Cy3,从而使Cy5处于荧光态。激发过程中应使532nm绿光强度足够低,以保证在衍射极限范围内至多只有一个Cy5荧光分子被激活至荧光态。而后,用波长为633nm的红色激光照射待观察样品,使处于荧光态的Cy5分子发射荧光。通过电子相机读取荧光图像,采用函数拟合的方法对图像进行处理,进而确定每个荧光点的中心位置。经过足够多次数循环后对获得的荧光点位置进行叠加,最终得到超分辨显微图像。

  PALM技术中,使用GFP突变体作为光活化蛋白(PA-GFP)来标记靶蛋白,并在细胞中表达。用405nm激光器低能量照射细胞表面,一次仅激活出稀疏分布的几个荧光分子,然后用561nm激光激发得到荧光,通过高斯拟合来精确定位这些荧光分子,在确定这些分子的位置后,长时间使用561nm激光来漂白这些已经定位正确的荧光分子后,使他们不能够被下一轮的激光再激活出来。再分别用405nm和561nm激光来激活、激发和漂白其他荧光分子,多次成像后,将这些分子的荧光图像合成到一张图上,得到了比传统光学显微镜至少高10倍以上的分辨率。PALM显微镜的分辨率仅仅受限于单分子成像的定位精度,理论上来说可以达到1nm的数量级。PALM的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质,而对于分辨细胞内源蛋白质的定位无能为力。

  STROM与PALM的基本原理一致,九州酷游网址区别在于STORM使用的荧光开关基团是有机荧光分子对,而PALM使用的荧光开关基团是荧光蛋白分子,由于STORM具有对细胞内源性生物分子成像的优势,目前STORM在活细胞等生物体系的应用更加广泛。在空间分辨率上,STORM可以达到10-20nm,PALM可以达到20-30nm;在时间分辨率上,STORM可以达到1s,而PALM约为30s。

  目前PALM专利技术转让给了ZEISS公司,STORM专利技术转让给了Nikon公司,两家公司都推出了商业化的超分辨显微系统产品。

  ①倒置荧光显微镜。可以用于激光扫描共焦显微成像或者单分子PALM显微成像。

  ②半导体激光器。405nm激光器作为激活光,561nm激光器作为激发光,激光器波长的选择是要和使用的光活化蛋白的特性有关,用于激发荧光的激光器波长一般包括488、561、594、635nm。激光器功率一般在50-200mW。为了光路调节的方便,一般要求激光器输出光斑质量要好。

  ③自由空间或光纤多波长耦合器。自由空间耦合器可以使得更高功率的激发和激活激光进入显微镜系统,使得成像过程可以更快。

  ④快门或AOTF(Acousto-Optic Tunable Filter声光可调滤波器)。快门或AOTF的作用是切换激活光和激发光,使得激活光和激发光依次照射在样品上,实现快速光开关的目的。在空间光输入到显微镜之前,使用AOTF可以使得进入显微镜的光强最大。

  ⑤激发滤光片、二向色片、长通滤光片。用于收集荧光信号最大,同时阻挡激发光,使得保证信噪比,消除残余光和自发荧光。

  ⑥TIRFM(全内反射荧光显微镜)物镜。TIRFM物镜的作用是使光束在样品表面发生全内反射,用以提高图像的信噪比。同时TIRF物镜的数值孔径都比较大,会有比较好的光子收集效率。

  ⑦EMCCD或sCMOS相机。相机要在可见光范围内有较高的量子效率、较高的帧速、较低的噪声。

  ⑧高精度纳米位移台及光学隔震平台。高精度纳米位移台及光学隔震平台可以减小漂移,对单分子成像的精度非常重要。

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